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Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1227 (2022) Citar este artículo tubería de teflón

Cómo las bacterias pueden mantener su tamaño sigue siendo una pregunta abierta.Se requieren técnicas que puedan medir la biomasa (masa seca) de células individuales con alta precisión y alto rendimiento para aclarar esta pregunta.Aquí presentamos un enfoque tecnológico que combina el transporte, la guía y el enfoque de bacterias individuales desde la solución hasta la superficie de un resonador de membrana de nitruro de silicio ultrafino en el vacío.Las frecuencias de resonancia de la membrana experimentan variaciones abruptas en los instantes en que las células individuales aterrizan en la superficie de la membrana.El diseño del resonador muestra una forma rectangular casi simétrica con un área de captura extraordinaria de 0,14 mm2, mientras mantiene una alta resolución de masa de 0,7 fg (1 fg = 10-15 g) para resolver con precisión la masa seca de las células individuales.La pequeña forma rectangular de la membrana proporciona una densidad de frecuencia de modos de vibración sin precedentes que permite recuperar la masa de células individuales con alta precisión mediante la teoría del problema inverso especialmente desarrollada.Aplicamos este enfoque para perfilar la distribución de masa seca en células de Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli.La técnica permite la determinación de la masa seca de células bacterianas individuales con una precisión de alrededor del 1% a un rendimiento sin igual de 20 células/min.Finalmente, revisamos el modelo de Koch & Schaechter desarrollado durante 60 s para evaluar las fuentes intrínsecas de estocasticidad que originan la heterogeneidad del tamaño celular en poblaciones en estado estacionario.Los resultados revelan la importancia de la resolución de masas para describir correctamente estos mecanismos.

A pesar de décadas de investigación, la forma en que las bacterias regulan el tamaño sigue siendo una pregunta abierta1,2,3,4,5.La mayor parte de nuestro conocimiento sobre el crecimiento celular y la regulación del tamaño es una descripción promedio de las poblaciones celulares.Sin embargo, las poblaciones celulares son intrínsecamente heterogéneas debido a mecanismos estocásticos y deterministas.La diversidad resultante juega un papel esencial en la función biológica.Una mayor comprensión de los mecanismos de regulación del tamaño de las bacterias requiere de técnicas que puedan medir con precisión células individuales en poblaciones6.El tamaño de la celda se puede cuantificar por volumen o masa, sin embargo, ambos parámetros son extremadamente sensibles a las condiciones ambientales, como la humedad y la presión osmótica que modifica el contenido de agua que representa el 60-80% de la masa total7.La masa seca, la masa del contenido no acuoso de la célula, ha ganado cada vez más atención ya que proporciona información sobre la cantidad de todos los constituyentes de las células bacterianas, a saber, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos8.La masa seca de una sola célula puede considerarse como el indicador más preciso de los procesos biosintéticos y degradativos dentro de una célula6.Recientemente se han desarrollado varias tecnologías para medir la masa seca de células individuales, como resonadores de microcanal suspendidos, microscopía de fase cuantitativa y técnicas basadas en espectrometría de masas (MS).El primer enfoque determina la masa flotante de células individuales que fluyen a través de un microcanal suspendido midiendo las variaciones en las frecuencias de resonancia del microcanal9,10,11,12,13,14,15.La determinación de la masa seca de la bacteria requiere medir la misma célula en dos fluidos de diferente densidad.Esta técnica proporciona una alta resolución de masa (<1 fg), sin embargo, es técnicamente compleja.la imagen de fase cuantitativa (qpi) utiliza la interferometría luz para medir el cambio una onda después atravesar celda16,17,18.el hecho que relación entre índice refracción y densidad masa biomolecular celular se encuentre dentro un rango muy estrecho19,20 permite calcular seca las células con alto rendimiento gran simplicidad.sin qpi no puede utilizar determinación precisa pequeñas como bacterias debido a resolución espacial limitada al ruido fase.finalmente, han desarrollado dos enfoques básicos basados ​​en ms individual partículas biológicas previamente ionizadas en ultra vacío, uno mide masa-carga solo ion varios pasos carga inferir masa21, otro refiere los detección (cd) miden simultáneamente iones individuales22,23,24,25,26.el primer método obtener>100 MDa como células bacterianas.Sin embargo, este método ha sido poco difundido debido a su complejidad, el largo tiempo de medición por ión y el escaso número de iones medidos, normalmente unas pocas decenas25,26.Por el contrario, CD-MS se ha convertido en la técnica de MS más extendida para medir distribuciones de masa de iones con masas muy por encima de la MDa, como grandes complejos de proteínas y virus pequeños, debido a la capacidad de medir miles de iones en períodos de decenas de minutos22, 23,24,25.Sin embargo, la resolución de masas disminuye rápidamente para masas más altas25,26, lo que impide, con muy pocas excepciones27, la medición de virus grandes con masas superiores a 100 MDa (por ejemplo, virus de la influenza, VIH, herpesvirus, SARS-CoV-2, virus similares al Ébola). virus, etc.) y células bacterianas con masas de decenas a cientos de GDa.

La espectrometría de masas nanomecánica (NMS, por sus siglas en inglés) basada en detectores mecánicos a micro-nanoescala ha surgido recientemente como la única técnica que puede 'pesar' directamente partículas biológicas individuales desde la escala nanométrica a la escala micrométrica, como proteínas, virus y células, con una resolución sin precedentes y sin cualquier suposición sobre sus propiedades físicas28,29,30,31,32,33.En NMS, las partículas biológicas se ionizan suavemente desde una solución acuosa a la fase gaseosa mediante ionización por electropulverización (ESI) y, posteriormente, se guían a la superficie de un resonador mecánico de micro-nanoescala, generalmente en (ultra)alto vacío y, muy recientemente, a presión atmosférica33.A medida que cada partícula se acumula en el resonador, se observan descensos abruptos en la frecuencia de los modos de vibración del resonador que son directamente proporcionales a la masa de la partícula independientemente de su estado de carga28,34,35,36.Una limitación importante de la espectrometría de masas nanomecánica es la pobre eficiencia de detección definida como la fracción de partículas nebulizadas del solvente que llega al detector mecánico.Las mejores eficiencias de detección reportadas para partículas biológicas están entre 10−9 y 10−7, dependiendo de las características de las partículas y las condiciones experimentales, lo que lleva tanto a tiempos de análisis largos como a un consumo excesivo de muestras.La baja eficiencia se debe principalmente al compromiso entre el tamaño del resonador mecánico y la masa mínima detectable.Cuanto más pequeño es el dispositivo, más susceptible es la frecuencia resonante a las masas añadidas minúsculas.Sin embargo, cuanto más pequeño es el dispositivo, más improbable es que la partícula se acumule en el resonador.Sorprendentemente, NMS se ha basado en resonadores tipo haz 1D con una relación de largo a ancho típicamente> 10, una geometría que es claramente ineficiente para lograr un área de captura alta al tiempo que conserva una sensibilidad de masa alta.

Aquí proponemos el uso de membranas rectangulares 2D ultrafinas (50 nm de espesor) (400 × 350 μm2), para la espectrometría de masas nanomecánica de bacterias.Encontramos que estas estructuras satisfacen de manera óptima el compromiso entre un área de captura grande y una resolución de masa alta.Desarrollamos una teoría del problema inverso para recuperar la masa individual de células bacterianas a partir de los cambios en las propiedades vibratorias de este tipo de estructuras.Aplicamos nuestra técnica a dos especies de bacterias, Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli K-12.Los resultados demuestran el potencial sin precedentes de la espectrometría nanomecánica basada en resonadores 2D ultrafinos para la detección rápida de la masa seca de microorganismos y para describir con precisión la variación de célula a célula.

El instrumento consta de cuatro etapas de vacío diferencial con presión decreciente (Fig. 1a, izquierda).La primera etapa alberga una fuente de ionización por electropulverización (ESI) a presión atmosférica que genera células bacterianas cargadas en su mayoría desolvatadas.Luego, las bacterias son atraídas inmediatamente por la segunda etapa, un capilar a 10 mbar que se calienta a 150 °C para desolvatar por completo las microgotas y evitar que las bacterias se adhieran a la pared interna del capilar.Las partículas cargadas a la salida del capilar calentado entran en el sistema de aerolentes que comprende un largo capilar seguido de dos skimmers consecutivos37.Las simulaciones numéricas por el método de elementos finitos (FEM) muestran que las células se ralentizan en el capilar desde velocidades supersónicas (600–700 m/s) hasta decenas de m/s, logrando un flujo laminar (Fig. 1a, derecha).Los skimmers dan lugar a un haz de celda estrecho colimado en la cuarta cámara de vacío diferencial a 0,1 mbar que alberga el chip resonador a solo 14 mm por debajo.Cerca del resonador, las células bacterianas se desaceleran cada vez más hasta que aterrizan 'suavemente' en la superficie del resonador38.El aterrizaje suave da como resultado morfologías celulares bien conservadas con pequeñas áreas de contacto con la superficie del resonador (Fig. 1b).Además, la presión de vacío en la cámara del detector es más de cuatro órdenes de magnitud mayor que en cualquier clase de espectrometría de masas nativa, lo suficientemente baja como para eliminar el contenido de agua de las bacterias, mientras que lo suficientemente alta como para mantener la estructura nativa de las células.

a Esquemas del instrumento (izquierda) y estimación de la velocidad de flujo absoluta calculada por FEM (derecha).Las células bacterianas siguen aproximadamente las líneas de flujo.b Imagen de microscopía electrónica de barrido de una célula de S. epidermidis en una superficie de silicio en la posición del detector después de la nebulización.c Densidad de superficie celular en la superficie de posición del detector por unidad de tiempo para una nebulización de S. epidermidis.La densidad de la superficie celular se caracteriza por microscopía óptica de campo oscuro y el conteo digital posterior de los puntos de dispersión celular.d Estimación de la eficiencia de captura (arriba) y el tiempo medio entre eventos de adsorción (abajo) en función del área del detector.Los datos se calculan integrando la tasa de densidad de la superficie celular (c) en una región rectangular que maximiza el número de células recolectadas.Las líneas rojas discontinuas marcan los datos de la membrana utilizada en este trabajo.

Caracterizamos la eficiencia de detección de nuestro instrumento, que se puede expresar como el producto de la eficiencia de transmisión y la eficiencia de captura.La primera cantidad es la fracción del número de partículas nebulizadas desde el disolvente a las condiciones ambientales que llegan a la etapa de vacío del detector.La eficiencia de transmisión es independiente del detector mecánico y depende únicamente de la arquitectura del instrumento.La eficiencia de captura, a su vez, está determinada por la relación entre el área de detección efectiva del resonador y la sección transversal del haz de la celda cargada en la posición del resonador.La distribución celular en la posición del resonador después de la nebulización se caracterizó mediante microscopía de campo oscuro y algoritmos de procesamiento de imágenes (Fig. 1c).Las celdas se ubicaron en una región con ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) de ~ 1.6 × 1.2 mm, como se muestra en la Fig. 1c.para S. epidermidis.Los datos de E. coli siguen un comportamiento muy similar (Fig. 1 complementaria).Estimamos una eficiencia de transmisión de alrededor del 0,03% que es similar al estado del arte anterior29,30.La mayoría de las células perdidas surgen de la distancia entre la aguja ESI y el capilar calentado.La distancia debe ser lo suficientemente cercana para asegurar una alta transmisión, pero también lo suficientemente grande para evitar que entren gotas de agua en el sistema de vacío.La eficiencia de captura en función del área del detector se estima integrando la densidad de la superficie celular en una región rectangular que maximiza el número de células recolectadas (Fig. 1d, gráfico superior).La eficiencia de captura es de alrededor del 5% para las membranas de nitruro de silicio ultrafinas utilizadas en nuestro trabajo, que es dos órdenes de magnitud mayor que en trabajos anteriores de NMS que operan en vacío29,30.Hacemos hincapié en que el área de captura extraordinariamente grande no compromete la resolución de masa para caracterizar bacterias debido al grosor a nanoescala de las membranas y el ancho de línea estrecho de los modos de vibración de la membrana, como se muestra a continuación.Calculamos el tiempo medio esperado entre los eventos de adsorción celular en función del área del resonador (Fig. 1d, gráfico inferior).En nuestras condiciones experimentales (109 células/mL y velocidad de flujo de 300 nL/min), predecimos un intervalo de tiempo medio entre eventos de 2 a 3 s, que es similar al observado experimentalmente.Los resonadores tipo haz que se utilizan tradicionalmente para la detección de masas rara vez superan las áreas de captura de aproximadamente 1000 µm2, lo que proporciona un intervalo de tiempo medio entre eventos de minutos e incluso horas para los dispositivos más pequeños.

Diseñamos membranas de nitruro de silicio ultrafinas de 50 nm de espesor con longitudes laterales Lx = 400 μm y Ly = 350 μm (Fig. 2a).La pequeña diferencia entre las longitudes, del 12,5 %, juega un papel clave en el rendimiento de nuestra tecnología, como se analiza a continuación.Las formas del modo de vibración de las membranas se midieron experimentalmente mediante microscopía holográfica digital estroboscópica (Fig. 2b)39.Las formas del modo de vibración experimental están bien descritas por la teoría de la elasticidad lineal de las placas para el régimen en el que la rigidez de la membrana inducida por la tensión es mucho mayor que la rigidez a la flexión40.En este caso, los modos propios se describen mediante \({\psi }_{{ij}}=2{\sin }\left[\frac{i\pi }{{L}_{x}}x\right] {\sin }\left[\frac{j\pi }{{L}_{y}}y\right]\) , donde el identificador de modo (i,j) se refiere al número de antinodos en x e y direcciones a lo largo de los lados largo y corto de la membrana, respectivamente.El desplazamiento de la membrana se midió mediante el método de desviación del rayo láser (Fig. 1a y Fig. 2 complementaria)41.Para maximizar la resolución de masa por el método del problema inverso, medimos simultáneamente la frecuencia de seis modos de vibración: (1,1), (2,1), (1,2), (3,1), (1, 3) y (3,2), mediante bucles de enganche de fase digitales (PLL).La oscilación de la membrana fue impulsada por un actuador piezoeléctrico justo debajo del chip de la membrana.El cuarto modo de vibración, (2,2), se excluyó porque no se pudo excitar eficientemente en nuestras condiciones experimentales.Los espectros de frecuencia de los modos de vibración seleccionados se muestran en la Fig. 2c.Las frecuencias de resonancia están ubicadas en 470, 715, 770, 995, 1105 y 1170. Estos valores coinciden aproximadamente con los valores teóricos dados por \({\nu }_{{ij}}=\frac{1}{2}\sqrt {\izquierda({\izquierda(\frac{i}{{L}_{x}}\derecha)}^{2}+{\izquierda(\frac{j}{{L}_{y}}\ right)}^{2}\right)\frac{\sigma }{\rho }}\) , para una tensión de tracción σ = 0,19 ± 0,02 GPa, suponiendo una densidad ρ = 2900 Kg m−3 (consulte la sección Métodos) .Los factores Q correspondientes son muy altos en nuestras condiciones de bajo vacío, de aproximadamente 1500, 2700, 3000, 3000, 3500 y 4100, respectivamente.El ruido de frecuencia de los seis modos de vibración se estimó calculando la desviación de Allan42,43 (Fig. 2d).En tiempos de integración cortos, la desviación de Allan disminuye con la raíz cuadrada del tiempo de integración y es inversamente proporcional a la amplitud, lo que es consistente con la estabilidad de frecuencia dominada por el ruido de fase blanco.Para tiempos de integración entre 0,3 y 2 s, las desviaciones de Allan alcanzan el mínimo de ∼ 10−7, y luego aumentan hasta lograr un régimen asintótico donde las desviaciones de Allan aumentan linealmente con el tiempo de integración debido a fuentes de ruido similares a la deriva.La principal fuente de deriva surge del efecto de la temperatura sobre la tensión de la membrana44.Minimizamos la deriva de frecuencia propia esperando 3-4 h para la estabilización térmica del sistema antes de las mediciones.El análisis de desviación de Allan proporciona una masa mínima detectable de ~0,7 fg para una partícula ubicada en el centro de la membrana cuando se mide la frecuencia de resonancia fundamental.

una imagen de microscopía óptica del dispositivo.La membrana de nitruro de silicio muestra una mayor reflectividad que el marco de silicio.La membrana tiene un grosor de 50 nm y tiene forma de rectángulo con lados de 400 µm y 350 µm.Los círculos rojos marcan la posición óptima donde se enfoca el rayo láser para medir los seis modos de vibración seleccionados (Fig. 2 complementaria).b El mapa de amplitud de los primeros nueve modos de vibración de la membrana medidos por microscopía holográfica digital estroboscópica.c Respuesta en frecuencia de los modos de vibración seleccionados de la membrana.d Allan desviación de los modos de vibración seleccionados de la membrana.

Ahora dirigimos nuestra atención al efecto de la rectangularidad de la membrana en el desempeño de la técnica.En membranas perfectamente cuadradas, los modos de vibración i ≠ j, son degenerados, es decir, los modos (i,j) y (j,i) vibran a la misma frecuencia45.Sin embargo, pequeñas imperfecciones inevitables debidas al proceso de fabricación o pequeños adsorbatos en la membrana rompen la degeneración de estos modos, dividiendo la frecuencia de resonancia degenerada en dos frecuencias de resonancia muy cercanas46.Esta configuración es altamente inestable ya que cualquier evento de adsorción puede modificar el orden de frecuencia de estos dos modos, dando lugar a soluciones erróneas por el método del problema inverso.La rectangularidad utilizada aquí es lo suficientemente alta para una ruptura estable de la degeneración de frecuencia, es decir, el modo de vibración (i,j) tiene una frecuencia más baja que (j,i) para i > j, independientemente de los eventos de adsorción acumulados.Muy importante, la rectangularidad es lo suficientemente pequeña para mantener un área de captura casi simétrica que se necesita para optimizar la eficiencia de detección.Además, la densidad de frecuencia de los modos de vibración aumenta significativamente a medida que cada modo degenerado se divide en dos modos cercanos, pero desacoplados.Tenga en cuenta que la relación de frecuencia entre el modo de vibración 7 y el modo fundamental es solo de aproximadamente 2,5, lo que simplifica significativamente el seguimiento de frecuencia de una gran cantidad de modos de vibración como se realiza aquí.

Aquí describimos la tubería para la determinación de la masa seca de las células bacterianas.El proceso comienza midiendo los cambios de frecuencia fraccionarios de los modos de vibración seleccionados de la membrana durante la nebulización de la solución bacteriana.La figura 3a muestra un breve registro en tiempo real de estas señales durante la nebulización de células de S. epidermidis.Estas curvas se caracterizan por mesetas intercaladas con variaciones casi instantáneas, denominadas aquí "saltos de frecuencia", que ocurren simultáneamente en varios modos de vibración.Los saltos de frecuencia se identifican como eventos de adsorción celular "tentativos" si el cambio de frecuencia de al menos tres modos de vibración es al menos el doble de la desviación estándar de sus fluctuaciones de frecuencia correspondientes.En este experimento, se identificaron 11 eventos de adsorción tentativa en el lapso de tiempo de 27 s.Elegimos un tiempo de integración PLL de 140 ms para medir las frecuencias de resonancia de la membrana, lo que proporciona un buen compromiso entre la precisión y la capacidad para resolver saltos de frecuencia cercanos temporalmente (ver Fig. 2d).Para membranas altamente tensadas, la adsorción de partículas induce cambios en la energía cinética debido a la masa añadida de la partícula, mientras que la energía potencial se ve insignificantemente afectada por la rigidez de la partícula34,35.En estas condiciones, el cambio de frecuencia relativa de un modo de vibración inducido por la adsorción de una partícula en la posición de la membrana (x0,y0) viene dado por,

donde M es la masa de la membrana y m es la masa de la partícula.Observe que debido a la simetría inherente de la membrana, existen cuatro posiciones de adsorción simétricas donde los cambios en las frecuencias propias son idénticos.En aras de la simplicidad, en lo sucesivo el análisis se limita a una cuarta parte de la membrana.Aquí resumimos brevemente el método del problema inverso, dejando los detalles para la Nota complementaria 1. La resolución de la masa y la posición de la partícula requiere al menos la medición de tres modos de vibración.En ausencia de ruido, el problema inverso está bien planteado, es decir, la solución inversa (m,x0,y0) se asigna a una única solución directa \(\left(\frac{\triangle {\nu }_{11}} {{\nu }_{11}},\frac{\triángulo {\nu }_{21}}{{\nu }_{21}},\frac{\triángulo {\nu }_{12}} {{\nu}_{12}}\derecho)\) .Tenga en cuenta que esta relación bidireccional uno a uno no se puede obtener con otra elección de modos.El ruido de frecuencia hace que el problema esté mal planteado, el problema no es invertible para todas las salidas de frecuencia posibles y la solución inversa se recupera en términos de probabilidad en lugar de una solución determinista.La precisión del método del problema inverso aumenta con el número de modos de vibración medidos como se hace aquí.Cada salto de frecuencia se caracteriza por un valor medio y una desviación estándar.La función de densidad de probabilidad (PDF) del vector de desplazamiento de frecuencia propia fraccional \(\hat{\Omega }=\left[\frac{\triangle {\nu }_{11}}{{\nu }_{11}}, \frac{\triángulo {\nu }_{21}}{{\nu }_{21}},\frac{\triángulo {\nu }_{12}}{{\nu }_{12}}, \frac{\triángulo {\nu }_{31}}{{\nu }_{31}},\frac{\triángulo {\nu }_{13}}{{\nu }_{13}}, \frac{\triangle {\nu }_{32}}{{\nu }_{32}}\right]\) , debido a una adsorción de partículas viene dada por,

donde \(\hat{\triangle }\) es el vector del cambio de frecuencia medio, Σ es la matriz de covarianza y N es el número de modos de vibración.Al sustituir el vector de frecuencia propia fraccional, \(\hat{\Omega }\), por su dependencia teórica explícita en la ecuación.(1), construimos la densidad de probabilidad conjunta de la partícula de masa y la posición de adsorción.En lugar de seleccionar un método de recuperación como el error cuadrático medio mínimo (MMSE), la probabilidad máxima (ML) o la probabilidad máxima a posteriori (MAP)47, aquí proporcionamos por separado las funciones de densidad de probabilidad para la masa y la posición de las células bacterianas. .

un registro en tiempo real de los cambios de frecuencia fraccionarios de los seis modos de vibración seleccionados de una membrana ultrafina durante la exposición a un flujo de células cargadas de S. epidermidis.El aterrizaje suave de células individuales en la membrana da lugar a cambios casi instantáneos y simultáneos de las frecuencias propias rastreadas.Los 11 eventos de adsorción tentativa observados están numerados.b Imagen óptica de campo oscuro de la membrana después del experimento que se muestra en a.Las posiciones de las bacterias estimadas por el método del problema inverso se muestran como círculos.La mayoría de las posiciones predichas coinciden con puntos de campo oscuro que se corresponden con células bacterianas.Los eventos 5 y 6 no pudieron resolverse por el método inverso debido a su corta separación temporal.c Función de distribución de probabilidad (PDF) de la masa de bacterias individuales obtenida por el método del problema inverso.Los PDF están normalizados al máximo.Los recuadros muestran una imagen SEM detallada de las células bacterianas identificadas en cada posición numerada.d Masa media de las bacterias derivada por el método del problema inverso frente al volumen estimado a partir de las imágenes SEM de las bacterias.El error de masa corresponde a la desviación estándar de las PDF de masa seca.El volumen se estima asumiendo un elipsoide para la forma de la bacteria.Usamos el valor medio de los diámetros en el plano para el diámetro fuera del plano.El error de volumen se obtiene a partir de la incertidumbre en los tres diámetros del elipsoide.

El método del problema inverso propuesto se aplica a los saltos de frecuencia observados en la Fig. 3a.Se encuentran soluciones inversas para todos los eventos, excepto para el quinto y el sexto que no pueden resolverse claramente debido a la corta separación temporal, de unos 400 ms.Las posiciones de adsorción con mayor probabilidad para los eventos restantes se comparan con las posiciones de los puntos de dispersión en la membrana obtenidos por microscopía de campo oscuro después de los experimentos (Fig. 3b).Observamos que las posiciones previstas están muy cerca de los puntos de acceso de campo oscuro.Las distribuciones de probabilidad de masa correspondientes alcanzan su punto máximo en masas entre 200 y 350 fg (Fig. 3c).Estos picos se ensanchan significativamente a medida que las partículas están cerca de los bordes de la membrana, donde las amplitudes de los modos propios son más pequeñas.Este es especialmente el caso de la partícula 2, cuya posición derivada se desvía significativamente de su posición real y su amplia distribución de masas impide una cuantificación precisa de su masa.Posteriormente, se muestra cómo los eventos mal resueltos son excluidos del análisis en base a criterios matemáticos.Comparamos las masas obtenidas por el método inverso con los tamaños obtenidos por imágenes SEM de las bacterias identificadas en la membrana (recuadros de la Fig. 3c).Encontramos que las células de S. epidermidis están presentes en diferentes etapas de crecimiento, en consonancia con la población en estado estacionario de células en crecimiento asincrónico.Por ejemplo, la celda 3 y la celda 9 estaban bajo división.Encontramos una buena correlación entre la masa celular media estimada por el método del problema inverso y los tamaños estimados a partir de las imágenes SEM.La pendiente entre la masa predicha y el volumen estimado a partir de las imágenes SEM es de unos 800 ± 200 Kg/m3, similar a los valores de densidad reportados previamente (Fig. 3d)29,48.

En la Fig. 4a se muestra un registro en tiempo real de 42 minutos de los cambios de frecuencia fraccional de los modos de vibración seleccionados de la membrana durante la ESI de S. epidermidis.Se encontraron alrededor de 900 eventos de adsorción tentativa.No todos los eventos se pueden resolver con el método del problema inverso.Una pequeña parte son artefactos y pueden surgir de ruidos electrónicos espurios, perturbaciones mecánicas externas o errores en el método de selección de salto.Otros eventos tentativos de adsorción son ciertos, pero los saltos de frecuencia no se miden con precisión debido a la baja relación señal/ruido.Esto suele ocurrir cuando las células se adsorben cerca de los bordes de la membrana, como se muestra en la sección anterior.Imponemos una condición de admisibilidad a los eventos de adsorción tentativa basada en dos reglas de selección: i) la posición de mayor probabilidad de la partícula obtenida por el método del problema inverso debe estar separada de los bordes de la membrana más del 6% de la longitud y ii) la posición de Pearson El coeficiente de correlación entre las amplitudes cuadradas del modo propio en la posición de partículas de mayor probabilidad y los cambios descendentes de frecuencia propia experimentales deben ser superiores a 0,9 (Nota complementaria 1).Suponiendo que el modelo que relaciona los parámetros de las partículas con las propiedades vibratorias de la membrana es correcto, un evento de adsorción real da lugar a un coeficiente de correlación de 1 para una medición sin ruido y disminuye con la frecuencia del ruido.Además, los eventos falsos darán como resultado correlaciones lineales bajas anómalas y, finalmente, posiciones de adsorción cerca de los bordes de la membrana.Después de imponer estas reglas de selección, el número de eventos válidos se reduce al 70% de los eventos identificados tentativamente.Los datos resultantes muestran que la biomasa de una sola célula es muy variable, lo que lleva a distribuciones de masa que cambian rápidamente con el número de células medidas para N ≲ 100 (Fig. 4b, c).Los parámetros estadísticos que describen la distribución de masa comienzan a alcanzar el régimen asintótico para N ≳ 300. La distribución de masa seca final (N = 628) exhibe una distribución amplia con media y desviación estándar de 153 ± 69 fg, discretizada con picos estrechos que sugieren masa valores con mayor probabilidad.Este efecto puede atribuirse a la alta resolución de masa, con una mediana de 3 fg, que permitió resolver variaciones del 2% en la masa de células individuales de S. epidermidis.De hecho, cuanto peor es la resolución de masa, más amplia es la distribución de probabilidad asociada a una sola celda, lo que resulta en distribuciones de masa más suaves, como las observadas por técnicas ópticas y eléctricas49,50.Nuestra precisión de masa es suficiente para describir la variabilidad de celda a celda, como se muestra a continuación.

un registro en tiempo real de los cambios de frecuencia fraccionarios de los seis modos de vibración seleccionados de una membrana ultrafina expuesta a un flujo de células cargadas de S. epidermidis.Se observan cambios bruscos hacia abajo de las frecuencias propias cada pocos segundos.El cuadrado discontinuo del gráfico superior está ampliado en el gráfico inferior para facilitar la visualización de los eventos de adsorción.b Evolución secuencial de la función de distribución de probabilidad (PDF) de la masa seca celular con el número de células adsorbidas (c).PDF de masa seca normalizada después de la adsorción de las primeras 10, 30, 100, 300 y 628 células.

A continuación, investigamos la naturaleza de la heterogeneidad de la masa seca de las células bacterianas.Tanto el crecimiento celular como la división celular están sujetos a procesos estocásticos debido al ruido en la dinámica del circuito molecular, el ruido de partición y las fluctuaciones ambientales1,2,49,50,51.La heterogeneidad del tamaño de las células se ha cuantificado a menudo mediante parámetros estadísticos, a saber, el coeficiente de variación (CV).Los primeros intentos de relacionar la distribución del tamaño de las poblaciones en estado estacionario de células en crecimiento asincrónico con la fuente de la estocasticidad se remontan a los años sesenta en los trabajos iniciados por Koch & Schaechter52,53.Desafortunadamente, estos trabajos fueron luego ignorados, probablemente porque las técnicas en ese momento, principalmente el método Coulter, carecían de la precisión necesaria.Aquí revisamos estos conceptos teóricos para interpretar nuestros datos.Brevemente, la distribución de masa en estado estacionario de células en crecimiento exponencial que están libres de estocasticidad (distribución determinista o canónica) viene dada por \(\theta \left(m\right)=\frac{{m}_{d}}{ {m}^{2}}\) , cuando \(\frac{{m}_{d}}{2}\le m\le {m}_{d}\) y cero en caso contrario, donde md es el masa en la división.La estocasticidad en el crecimiento y división celular hace que la distribución de masa se desvíe de la distribución determinista, y es esta desviación la propiedad clave para describir la estocasticidad intrínseca de la población celular.La ecuación de Koch & Schaechter describe el efecto de la estocasticidad de la división celular en la distribución de masa (Fig. 5a, izquierda),

donde g(x) es la densidad de probabilidad de masa de las celdas en el instante de la división y A es una constante de normalización.La belleza de esta aproximación es que el coeficiente de variación (CV) para el crecimiento determinista es 0,2017.Por lo tanto, la estocasticidad intrínseca se refleja en un exceso de CV con respecto a este valor (Fig. 5b).También examinamos el efecto de la resolución de masa en la distribución de masa (Fig. 5a, derecha) y en el CV (Fig. 5b).Este efecto se ha pasado por alto en el pasado, pero puede dar lugar a una interpretación errónea de los datos.Encontramos que las resoluciones de masa superiores al 5% pueden distorsionar significativamente las distribuciones de masa e inducir un aumento falso del exceso de CV.Este efecto no es significativo en nuestra técnica, pero puede ser importante en otras técnicas con menor resolución de tamaño.

una izquíerda.PDF de la masa de una población en estado estacionario de células en crecimiento exponencial en función de la variabilidad de la masa celular en la división, tal como se describe en el modelo de Koch & Schaechter.La línea discontinua representa la distribución determinista.Derecha.Efecto del ruido de medida sobre una distribución determinista de masas celulares.b Efecto del ruido de división celular y el ruido de medición en el CV de la población en estado estacionario de células en crecimiento exponencial.c, d FDP relativa de poblaciones en estado estacionario de Staphylococcus epidermidis (N = 628) y Escherichia coli K-12 (N = 685).La línea discontinua representa el ajuste al modelo de Koch & Schaechter.

Aplicamos el modelo de Koch & Schaechter asumiendo una distribución normal de la masa de división a las distribuciones de estado estacionario de S. epidermidis (N = 628) y E. coli K-12 (N = 685; Fig. 5c, d).La masa seca media de S. epidermidis y E. coli fue de 153 y 469 fg, respectivamente.Los coeficientes de variación fueron 0,46 y 0,37, respectivamente.Aunque las distribuciones de tamaño de celda generalmente se ajustan a distribuciones normales y logarítmicas normales, estos modelos estadísticos no se fundamentan en ningún modelo de crecimiento50,51,53.Encontramos que el modelo de Koch & Schaechter se ajusta con un R-cuadrado más alto y permite inferir información sobre los parámetros de estocasticidad del crecimiento (Fig. 3 complementaria).El modelo proporciona una masa media en el instante de la división de 248 fg para S. epidermidis y 763 fg para E. coli.El CV de la masa de división fue de 0,31 y 0,27, respectivamente.Remarcamos nuevamente la relevancia de medir la masa seca con alta precisión para determinar las fuentes de estocasticidad intrínseca.La mayoría de los estudios sobre el crecimiento de células bacterianas se basan en imágenes ópticas en tiempo real de bacterias similares a varillas con longitudes que oscilan entre 2 y 10 µm y anchos de 0,2 a 1 µm.El volumen celular generalmente se cuantifica por la longitud suponiendo un ancho constante debido a la resolución espacial limitada.El CV de la longitud de división informado para las bacterias tipo bastoncillo se encuentra entre 10 y 15%50,54, de 2 a 3 veces más pequeño que el CV de la masa seca de división de E. coli informado aquí, lo que cuestiona el uso de la longitud como un tamaño confiable. indicador.Además, la limitación en la resolución espacial de las técnicas ópticas utilizadas impide el estudio del crecimiento celular de bacterias esféricas de menos de 1 µm, como las células de S. epidermidis estudiadas aquí.

Tanto el crecimiento celular como la división celular están sujetos al ruido en los circuitos moleculares, así como a las fluctuaciones ambientales.Sin embargo, las células son capaces de mantener su tamaño característico.Los mecanismos detrás de la regulación del tamaño celular aún no se conocen bien y siguen siendo una de las grandes preguntas en biología.A pesar de los rápidos avances en teoría y tecnologías, el tamaño de las células bacterianas individuales no se puede medir rápidamente con alta precisión.Mostramos que la resolución de tamaño juega un papel clave para describir correctamente la variabilidad del tamaño de celda.De hecho, una resolución de tamaño superior al 5% modifica significativamente los parámetros estadísticos de las poblaciones de células bacterianas.Además, la masa de una sola célula suele estimarse midiendo sus dimensiones en lugar de medir la masa de sus constituyentes biológicos, es decir, la masa seca que es el indicador más preciso.Presentamos aquí un enfoque tecnológico para caracterizar la masa seca individual de cientos de células bacterianas en pocos minutos con una precisión del 1%.Estos activos únicos permiten escudriñar los mecanismos que permiten que las células bacterianas mantengan su tamaño en su contexto ruidoso.

La geometría de la membrana se diseñó para (i) maximizar el área de captura manteniendo suficiente resolución de masa para medir con precisión la masa seca de las células bacterianas y (ii) romper la degeneración de frecuencia de manera estable mientras se maximiza el área de captura.Estos compromisos se cumplieron con membranas ultrafinas de nitruro de silicio de 50 nm de espesor con una longitud Lx = 400 μm y una anchura Ly = 350 μm.Los dispositivos fueron fabricados a medida por Norcada Inc (Canadá).Los parámetros críticos del dispositivo fueron caracterizados por Norcada Inc para los experimentos presentados.Las longitudes finales fueron Lx = 403 ± 3 μm y Ly = 353 ± 3 μm.El espesor de la membrana medido por un elipsómetro espectroscópico fue de 53,7 ± 2,0 nm.Norcada ajustó la estequiometría de nitruro de silicio de forma personalizada para tener una tensión y una densidad específicas.La densidad fue de 2900±50 Kg/m3.Los modos de vibración de la membrana se caracterizaron por microscopía holográfica digital de reflexión (DHM R-1000, Lyncée Tec, Suiza), con una lente objetivo de aumento 10x (Leica Camera AG, Alemania).Las mediciones se llevaron a cabo en una cámara de vacío casera a 10−3 torr.La presión se mantuvo mediante una bomba de vacío de paletas rotativas de dos etapas (TRIVAC E2 D2,5E, Oerlikon Leybold Vacuum GmbH, Alemania).La parte superior de la cámara de vacío aloja un vidrio delgado con revestimiento antirreflectante (ATG-401 de UQG Optics, Reino Unido) que permite la caracterización DHM.La membrana fue accionada por un actuador piezoeléctrico (miCos Iberia SL, España), justo debajo del dispositivo.La excitación piezoeléctrica de la membrana se sincronizó con iluminación estroboscópica pulsada por láser.Se registró el retardo de fase de ocho ciclos de oscilación de los modos de resonancia y se calculó la forma del modo de vibración (software desarrollado por Lyncée Tec).

El espectrómetro nanomecánico se compone de tres componentes básicos: la fuente de ionización por electropulverización (ESI), la cámara de vacío que consta de tres etapas de vacío diferencial y el detector que consiste en una membrana ultrafina de nitruro de silicio de 50 nm de espesor y un sistema de deflexión de haz láser para medir la Propiedades vibratorias de la membrana.La fuente de ESI consta de una aguja metálica de acero inoxidable (76 µm de DI, 152 µm de DE, 14,6 cm de largo, Thermo Fisher Scientific, 97,144–20,040) insertada en un tubo metálico de acero inoxidable (Merck, 56722) que se utiliza para suministrar un flujo de gas envolvente (N2 seco).La fuente ESI está conectada a una bomba de jeringa de alta presión (Base 120 Cetoni Gmbh, Alemania) ya una fuente de alimentación de alto voltaje (HV-7010 Ioner, RAMEM).Una fracción de las partículas cargadas generadas por ESI ingresan a la cámara de vacío a través del capilar calentado (0,5 mm de DI, 7 cm de largo) fabricado por Fasmatech (Grecia).La punta ESI está separada 10 mm de la entrada del capilar calentado.La solución de células bacterianas se pulverizó a un caudal de 0,3 μL/min y aplicando un voltaje de 2650 V entre la aguja ESI y la entrada de la cámara de vacío.La temperatura del capilar calentado se ajusta a 150 °C y la presión se mantiene a 10 mbar mediante una bomba rotativa (D8T Trivac Oerlikon Leybold Vacuum Gmbh, Alemania).El capilar calentado está incrustado en un tubo coaxial que se usa para hacer fluir una cortina de gas (N2 seco) hacia la fuente ESI.Los gases envolvente y de cortina se hicieron fluir a 150 ml/min.El gas envolvente ayuda a (i) dirigir el rociado a la cámara de vacío y (ii) desolvatar las gotas cargadas antes de ingresar a la cámara de vacío.El gas cortina, además de potenciar la desolvatación de las microgotas cargadas, contribuye a expulsar la entrada de contaminantes del aire en el capilar calentado.Las partículas cargadas a la salida del capilar calentado entran en el sistema de aerolentes (Fasmatech, Grecia) que consta de un capilar largo (3 mm de DI, 24 cm de largo) diseñado para desacelerar las partículas cargadas y lograr el régimen de flujo laminar, seguido de dos electrodos de lente consecutivos en forma de skimmer con diámetros internos de 2 mm y 1,5 mm, respectivamente, diseñados para enfocar las partículas cargadas en el detector de membrana colocado 14 mm por debajo de la cámara de vacío del detector mantenida a 0,1 mbar por una bomba turbomolecular (Turbovac 90i, Oerlikon Leybold Vacuum Gmbh, Alemania), que es retrobombeado por una bomba rotatoria sellada con aceite monoetapa (MS40+, Agilent technologies, Inc).Un actuador piezocerámico (miCos Iberia SL, España) se coloca debajo del dispositivo para excitar la vibración de la membrana.Se utiliza una etapa de nanoposicionador 3D (controlador piezoeléctrico ANC350, Attocube Systems AG, Alemania) debajo de la pila piezoeléctrica/membrana para alinear la superficie del resonador y el haz de células bacterianas cargadas.

El sistema de desviación del rayo láser consta de un diodo láser de potencia variable de 639 nm (Schäfter+ Kirchhoff Gmbh, Alemania) colocado fuera de la cámara de vacío que se enfoca a través de una ventana óptica en la cámara del detector hacia la superficie de la membrana.La potencia del láser se mantuvo en 550 µW para evitar el calentamiento fototérmico en la membrana que da como resultado una desviación de las frecuencias de resonancia.El diámetro del punto en la membrana era de aproximadamente 4 µm y se centró en las regiones marcadas en la Fig. 2a (Fig. 2 complementaria).El haz reflejado se recogió externamente a través de una ventana óptica opuesta en la cámara de vacío en un objetivo (10x, 0,28 NA, Mitutoyo, Japón) que colima el haz láser en un haz de 1 mm de diámetro antes de golpear el centro de un fotodetector de cuadrante (S4349, Hamamatsu , Japón).Las fotocorrientes generadas en los cuadrantes superior e inferior se amplifican por separado mediante dos amplificadores de corriente a voltaje de alta velocidad (DHPCA-100, FEMTO Messtechnik GmbH, Alemania).Las señales de voltaje de salida se conectan a la entrada diferencial de un amplificador de bloqueo digital (H2FLI-PLL Zurich Instruments AG, Suiza) que proporciona 2 bucles de bloqueo de fase (PLL) y 4 controladores proporcionales integrales derivados (PID).Las primeras dos frecuencias de resonancia de los dispositivos fueron rastreadas por los sistemas PLL y las otras cuatro fueron rastreadas configurando los controladores PID para bloquear las fases.

En primer lugar, se inocularon 10 mL de muestras de caldo Luria-Bertani (LB) con 100 µL de los cultivos en fase estacionaria de las cepas E. coli K-12 y S. epidermidis.Las soluciones de bacterias preparadas se cultivaron durante la noche a 37 °C con agitación.Luego, las soluciones de E. coli se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 min a 25 °C y las soluciones de S. epidermidis se centrifugaron a 4400 rpm durante 25 min a 25 °C.Se eliminó el sobrenadante y las soluciones restantes se resuspendieron en agua Milli-Q.Este proceso se repitió tres veces.Finalmente, las bacterias se resuspendieron en una solución de alcohol isopropílico al 50 %/agua Milli-Q al 50 % y se ajustó la concentración a 109 células por mL midiendo la densidad óptica (DO) a 600 nm con un Bioespectrofotómetro de Eppendorf (Alemania). .

Las distribuciones de masa que se muestran en este trabajo corresponden a 628 células de S. epidermidis y 685 células de E. coli.Los eventos de adsorción celular se excluyeron del análisis según los criterios matemáticos descritos en el texto principal y la Nota complementaria 1. Los datos que se muestran son consistentes con la repetición previa de los experimentos (más de tres para cada bacteria).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen subyacentes a la Fig. 3d se muestran en Datos complementarios 1. Los datos generados o analizados durante este estudio que no estén incluidos en los Datos complementarios 1 están disponibles a los autores previa solicitud.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 731868—VIRUSCAN y por la subvención ERC CoG 681275 "LIQUIDMASS".Agradecemos el servicio del Laboratorio de Micro y Nanofabricación y laboratorio X-SEM del IMN-CNM financiado por la Comunidad de Madrid (Proyecto S2018/NMT-4291 TEC2SPACE) y por MINECO (Proyecto CSIC13-4E-1794 con apoyo de FEDER, FSE ).EGS reconoce el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia e Innovación de España a través de la subvención Ramón y Cajal RYC-2019-026626-I.

Instituto de Micro y Nanotecnología, IMN-CNM, CSIC (CEI UAM+CSIC), 28760, Tres Cantos, Madrid, Spain

Adrian Sanz-Jimenez, Oscar Malvar, Jose J. Ruz, Sergio Garcia-Lopez, Priscilla M. Kosaka, Eduardo Gil-Santos, Alvaro Cano, Alvaro San Paulo, Montserrat Calleja & Javier Tamayo

Fasmatech Science & Technology, Lefkippos TESPA, Demokritos NCSR, Patriarchou Gregoriou & Neapoleos, 15341, Atenas, Grecia

Dimitris Papanastasiou y Diamantis Kounadis

Hospital Universitario La Paz, IdiPAZ, 28046, Madrid, Spain

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Dispositivos diseñados por ASJ, OM y JJR;ASJ, DP y DK;OM diseñó y construyó la instalación experimental;ASJ, OM, EGS, MC, ASP y JT diseñaron los experimentos;SG, JM y PMK diseñaron y realizaron los protocolos biológicos requeridos;AC realizó la caracterización DHM de los dispositivos;ASJ y OM realizaron los experimentos;ASJ, OM, JJR y JT analizaron los datos;JJR desarrolla los modelos teóricos;JT escribió el artículo con aportes de todos los autores.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.Editor principal de manejo: Gene Chong.

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Sanz-Jiménez, A., Malvar, O., Ruz, JJ et al.Determinación de alto rendimiento de la masa seca de células bacterianas individuales mediante resonadores de membrana ultrafina.Commun Biol 5, 1227 (2022).https://doi.org/10.1038/s42003-022-04147-5

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04147-5

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Biología de las comunicaciones (Commun Biol) ISSN 2399-3642 (en línea)

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